Elektronová mikroskopie část 2. - SEM a TEM

V minulém článku jsme hovořili obecně o elektronové mikroskopii. Nyní je však čas obeznámit vás s konkrétními metodami, s přípravou vzorků a způsoby detekce.

Není to zrovna dvakrát jednoduché, ale budu se snažit vám to co nejvíce přiblížit. Jako první si rozebereme Skenovací elektronový mikroskop, v češtině se také využívá název Rastrovací elektronový mikroskop, vzápětí se dovíte proč.

Skenovací/rastrovací elektronový mikroskop – SEM/REM

Ve Skenovací elektronové mikroskopii (SEM, REM) se využívá pohybu paprsku elektronů po vzorku v tzv. rastru (neviditelná mapka pohybu paprsku, něco jako linkovaný sešit, nemůžete si totiž na vzorek jen tak přilepit mřížku, bohužel). Vzorek následně vysílá buďto zpětně odražené elektrony (back scattered electrons – BSE detektor) nebo sekundární elektrony (secondary electrons – SE detektor). Samozřejmě se pak liší i výsledný obraz podle toho jaký detektor použijeme. Již zmiňovaný pohyb paprsku podle rastru je zajišťován pomocí tzv. rastrovacích cívek, které jsou umístěny hned pod elektromagnetickými čočkami zajišťujícími fokusaci – usměrnění paprsku.

Jako zdroj elektronů (electron gun) se používá například nažhavené wolframové vlákno, hrot z krystalu LaB₆ – boridu lanthanového (termoemisní zdroje) nebo zdroj využívající studenou emisi – hrot do kterého je vyleptané wolframové vlákno (elektrony jsou vytrhávány katodou umístěnou před hrot). Nyní se podíváme na princip fungování tří nejčastěji používaných detektorů.

Čas detekovat: Secondary Electron detektor

Název detektoru vypovídá, že jeho funkce je založená na snímání sekundárních elektronů jako takových, avšak pravda je v celku jiná. Sekundární elektrony jsou elektrony vyražené z povrchu vzorku dopadem paprsku. Jejich „vyražení“ je však doprovázeno „světélkováním“ – scintilací (SCINTILACÍ ne SLINTILACÍ, důrazně doporučuji u mikroskopu neslintat…), to je bohužel příliš slabé na to abychom na něm založili celou detekci. Proto je nutné použít fotonásobič, který toto světélkování zachytí, převede na elektrický signál a zesílí ho.

A k tomu nám slouží scintilační fotonásobič Everhart – Thornleyův detektor. Množství elektronů, které zachytí, závisí na úhlu dopadu paprsku na vzorek a čím je tento úhel větší, tím se zvětšuje i plocha kterou paprsek pojme. To má ve výsledném obrazu za následek zesvětlení hran a šikmých povrchů – 3D efekt. Bohužel je však zachyceno pouze 60 % elektronů z celkového objemu, takže detekce není tolik citlivá.

Detektor jako takový je umístěný ve Faradayově kleci v přepětí 200 kV aby napětí na scintilátoru neovlivňovalo dopadající paprsek. Soustava je umístěna mimo vakuum.
Tímto způsobem získáváme pouze topografické informace – informace o povrchu vzorku, signál pochází z hloubek jen několika nm.

Čas detekovat: Back scattered Electron detektor

Při detekci zpětně odražených elektronů se také využívá náš již zmíněný scintilační fotonásobič Everhart – Thornleyův detektor, je však umístěný hned za poslední elektromagnetickou čočkou. Detekce je založená na stejném principu jako u SE detektoru – zachytávají se světelné signály vyslané vyraženými elektrony ze vzorku. Tyto signály jsou způsobené elastickými srážkami elektronů z paprsku s atomy vzorku (jako kdybyste proti vzorku házeli miliony hopíků).

Intenzita signálu pak záleží na atomovém čísle (Z) – čím je Z vyšší, tím se atom zobrazí světleji než ostatní. Proto při použití BSE detektoru získáváme informace o materiálovém kontrastu vzorku.

Čas detekovat: Využití RTG záření – EDS/WDS disperzní rentgenová spektroskopie

Klid! Vím, že ten název zní naprosto příšerně a složitě ale hned vám to všechno vysvětlím. Zkratky EDS a WDS pouze popisují specializaci dané spektroskopie, EDS je založená na měření rozptýlené (dispergované, od slova disperze) energie (EDS). WDS je zase založena na měření rozptýleného vlnění (wave).

Celá detekce vychází z toho, že při působení elektronového paprsku na vzorek dochází k uvolňování rentgenového záření. Toto záření je charakteristické pro každý prvek tudíž získáváme informace o chemickém složení vzorku. Výstupem však v tomto případě není obrázek ale spektrum (odtud název spektroskopie).

Tato metoda slouží i ke zjištění koncentrace jednotlivých prvků ve vzorku, protože vysílané záření sledujeme v různých energetických hladinách. Intenzita se pak odráží ve zmiňovaném spektru výškou píku (pík je jedna samostatně rozlišitelná ostrá „špička“ v grafu, viz obrázek – Ba-Lα).

Čas na vzorečky

Nyní sice známe způsoby pozorování, nemáme však CO pozorovat. Proto je na čase vás obeznámit se získáváním vzorků pro SEM. Vzorky pro Skenovací elektronovou mikroskopii musejí splňovat hned několik poměrně přísných podmínek. Nemůžete venku jen tak urvat kus trávy, mrsknout ho na sklíčko a začít pozorovat jako je tomu u světelné mikroskopie.

Co pozorovat?

Naše vzorky se „mrskají“ na malé kovové destičky z hliníku, na kterých je nalepená oboustranná uhlíková páska. Nejčastěji se zkoumají nanomateriálové (oxidy železa, titanu, povrchy tenkých filmů…) nebo biologické vzorky (chrupavky, vaziva, tkáně). Problém biologických vzorků je, že obsahují vodu a ta se ze vzorku musí odstranit, protože při jejím kontaktu s proudem elektronů může dojít k explozi a tím ke zničení celého mikroskopu (trošku drahá záležitost).

Jejího odstranění je možné docílit buďto fyzikální nebo chemickou cestou (častěji využívaná). Jako první však musíme samozřejmě vzorek získat. Nezáleží na jeho tloušťce, protože v SEM se zkoumá především povrch. Následně musíme vzorek očistit od všech cizorodých částic, především od prachu, protože právě ten zkresluje obraz.

Následuje fixace, ta je velmi důležitá, protože zajistí stabilizaci vzorku a zamezí jeho degradaci. Provádí se nejčastěji formaldehydem nebo OsO₄ – oxidem osmičelým (ne, nemá osm čel). Následně musíme vzorek promýt tzv. pufry což jsou roztoky zajišťující stálé pH. Některé preparáty jsou totiž náchylné na výkyvy pH a mohou se pak začít rozkládat. Po promytí se konečně dostáváme k sušení, které se provádí nejčastěji ethanolem nebo acetonem. Vzorek se postupně promývá roztoky se zvyšující se koncentrací ředidel. Pak už se jen nechá ředidlo vypařit a můžeme preparát „přilepit“ na zmiňovanou destičku.

Vzorky raduly (šnečí „jazyk“) na uhlíkové pásce

Pokovování

Další podmínkou, která musí být splněna je povrchová vodivost. Preparáty upravené tak jak bylo výše popsáno jsou tepelně i elektricky nevodivé, což má za následek tzv. „nabíjení“, které je deformuje. Elektrickou vodivost tedy musíme zajistit pokovováním (tepelná vodivost není podstatná). Máme tři nejvyužívanější způsoby pokovování: vakuové napařování, iontové naprašování a impregnaci.

Vakuové napařování má postup následující: kov, třeba zlato nebo platina, se zahřeje ve vakuu na teplotu, při které se odpařuje. Odpařené molekuly se pak šíří všemi směry v nádobě a při dopadu na vzorek zkondenzují (vzorek má nižší teplotu, proto částice zkondenzují, jako když se orosí okno). Tím se na vzorku vytvoří tenká vrstvička kovu.

Iontové naprašování je založeno na usměrněném výboji v argonové atmosféře účinkem elektrického napětí (excuse me…what?). Principiálně jde o to, že díky elektrickému výboji se plyn tzv. zionizuje (přetvoří se na kationty). Tyto částice jsou přitahovány ke katodě (elektrodě se záporným nábojem), okolo ní je prstenec s kovem, kterým chceme náš vzorek poprášit. Ionty narážejí do prstence a unášejí s sebou částečky kovu, tím se vytvoří mrak, který obalí náš vzorek. Opět vznikne tenká vrstvička kovu.

Impregnace je chemické pokovení, nejčastěji jde o rozpuštění kovu v kyselině, preparát se pak do roztoku namočí a tím se opět obalí kovem.

SEM a TEM 07 — Schéma iontového naprašování

Transmisní elektronový mikroskop – TEM

A teď je načase vás seznámit i s druhým nejvíce používaným elektronovým mikroskopem a to TEM. Oproti SEM se transmisní elektronový mikroskop liší hlavně svou stavbou. U SEM jsou součásti seřazené v pořadí: zdroj elektronů → elektromagnetické čočky → detektor → preparátová komora. U transmisního EM je však preparátová komora umístěna mezi zdroj elektronů a čočky, protože vzorek proudem elektronů prosvěcujeme a je potřeba snímat elektrony prošlé ne odražené. Náš „detektor“ je umístěný až úplně vespod. Píšu to do uvozovek, protože to není detektor v pravém slova smyslu. Ve skutečnosti jde pouze o fluorescenční stínítko, na které se odráží obraz prosvíceného vzorku.

Transmitované (prošlé) elektrony narážejí do stínítka a excitují jeho povrch – luminofor. To má za následek jev zvaný luminescence (určitě všichni znáte světlušky a jejich zadečky), a ten nám umožňuje snímat obraz. Pozorovaní můžeme provádět buďto přímo – díváme se přímo na stínítko (které je samozřejmě za sklem), nebo můžeme pozorovat pomocí kamery, případně pořizovat fotografie. Musíme si však dát pozor abychom náš vzorek příliš dlouho nevystavovali proudu elektronů, protože se může lehko stát, že jej prostě a jednoduše propálíte. Zdroje jsou naprosto totožné s těmi u SEM, takže je už nebudu znova rozebírat.

Schwannovy buňky – buňky urychlující přenos nervového vzruchu (zobrazení pomocí TEM)

Čas na vzorky 2.0

Když to tedy shrneme, „detekce“ u TEM není nikterak složitá. Mnohem zajímavější je však vytváření vzorků. V případě těch práškových je nutné použít nějaký nosič. Nejčastěji jsou to kovové síťky (měď, hliník) nebo speciální folie z tzv. formvaru (z angličtiny polyvinyl formal resin – polyvinyl formová pryskyřice, slovo formová je od formaldehydu). Vzorek se rozpustí ve vhodném roztoku a pak se kápne na námi vybraný nosič. Necháme zaschnout a můžeme pozorovat. Ta pravá sranda však začíná u biologických vzorků, u nich se totiž musí tvořit ultratenké řezy, abychom je mohli co nejlépe prosvítit, a tak zkoumat detaily.

Jak na to?

Na začátku je postup stejný jako u SEM. Vzorek očistíme, zafixujeme roztokem formaldehydu a promyjeme kvůli odstranění zbytků činidla. Následně dehydratujeme acetonem nebo ethanolem, opět řadou roztoků se zvyšující se koncentrací. Dehydratace se musí provádět tak, aby se vzorek úplně nesrazil (ano…nepereme „na devadesát“). Opět necháme přebytky vypařit a následuje nová věc – „zalévání do bločků“.

Podstatou je, že náš již upravený vzorek zalijeme do nějaké pryskyřice, abychom ho mohli následně krájet na tenoučké plátečky. Provádí se to na stroji zvaném ultramikrotom (představte si ho jako hodně specializovaný kráječ salámu u řezníka).

Pryskyřici volíme podle typu vzorku, ale nejčastěji se používají epoxidové. Po zalití ji necháme zatuhnout a následně bloček seřežeme do požadovaného tvaru (čímž opravdu nemyslím, že ho chudáka zmlátíme opaskem…).

Pak už nám jen zbývá bloček upevnit do ultramikrotomu a udělat ultratenké řezy (jejich tloušťka by měla být v rozmezí 60–70 nm). K řezání se používají skleněné nebo diamantové nože (skleněné mají životnost cca 30 řezů, diamantové se prakticky neotupují), k nimž se objekt postupně přibližuje díky pohyblivému ramenu, které vzorek posouvá o přesnou vzdálenost, kterou si zvolíme. Tato vzdálenost nám určuje, jak tlustý řez bude. Konečnou fází už je jen připevnění na nosič a opět můžeme pozorovat.